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如何選擇熒光二抗點(diǎn)擊次數(shù):4214 更新時(shí)間:2010-11-30

                                               如何選擇熒光二抗
 

如何選擇二抗——根據(jù)一抗種屬及類型選擇合適的二抗

二抗廣義上是指專門和一抗進(jìn)行特異性反應(yīng)和結(jié)合的抗體,在免疫學(xué)反應(yīng)中,經(jīng)常需要針對試驗(yàn)選擇不同的二抗,檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇,同時(shí)在后繼試驗(yàn)中也會(huì)有不同的檢測方案,因此在選擇二抗的時(shí)候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測方案的要求,一般來說,選擇合適的二抗需要從下面幾個(gè)方面考慮:

【一抗的種屬來源】

二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源,例如:如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體,二抗則選抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可);如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體,則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。抗不同種屬的*二抗,包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、人、豚鼠、豬、馬、牛、雞、鴨等二抗。

【一抗的類別亞型】

二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白,因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。其中單克隆抗體的類別及亞類通常會(huì)在產(chǎn)品說明書中都會(huì)有描述,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgM。如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合,或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以選擇抗IgG1的二抗,此種抗體在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下,可以選用抗相應(yīng)物種IgG。通用的IgG(H+L)二抗,或者特異性只結(jié)合IgM的Anti IgM (mu) Antibody、IgA的Anti IgA (alpha-Antibody、IgE的Anti IgE (epsilon) Antibody等。

【二抗的種屬來源】

一般來說,不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的,來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里, 如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里,如果其中一個(gè)一抗是山羊來源的,一個(gè)是小鼠來源的,則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗,這時(shí)候,二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。

【二抗的耦聯(lián)標(biāo)記】

一般來講,耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶(辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP),熒光基團(tuán)(FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等)、生物素、金顆粒。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對于Western Blot和ELISA,zui常用的二抗是酶標(biāo)二抗;而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞免疫化學(xué),組織免疫化學(xué),流式細(xì)胞術(shù))中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗,免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號,可以使用Biotin/Avidin檢測系統(tǒng)。在一些熒光檢測方案中,則需要選擇不同的熒光標(biāo)記;而金顆粒標(biāo)記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。

【是否經(jīng)過血清吸附過的二抗】

為減少二抗與樣本的非特異性結(jié)合,需提供不同血清吸附的*二抗。如您的檢測樣本是人源的蛋白,一抗是小鼠源的單克隆抗體,二抗就需要選擇抗小鼠源的二抗,如果您對實(shí)驗(yàn)的特異性要求很高,那我們向您推薦經(jīng)過人血清吸附過的抗小鼠源的二抗,這種二抗由于經(jīng)過人血清吸附而排除了與人源組織(如IgG等)可能發(fā)生非特異性反應(yīng)的IgG,因此將非特異性結(jié)合降低到zui低。

【Anti-IgG還是Anti-IgG, F(ab’)2 fragment】

在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi),通常含有較多的Fc受體,這時(shí)候選擇二抗時(shí)選擇Anti-IgG, F(ab’)2 fragment這樣的特異性二抗,這樣就消除了由于Fc部分與IgG的非特異性結(jié)合。常規(guī)的Anti-IgG (H+L)二抗與IgG的重鏈和輕鏈都有結(jié)合反應(yīng),即與IgG的Fc的F(ab’)2片段都能結(jié)合;由于IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域,因此Anti-IgG (H+L)與它們都有交叉反應(yīng)。而Anti-IgG, F(ab’)2 fragment經(jīng)過了IgG Fc片段的吸附,因此只與IgG的F(ab’)2片段結(jié)合,然而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域,因此與它們也有交叉反應(yīng)。

【Anti-IgG(H+L)、Anti-IgG (gamma)、Anti-IgM (mu)、Anti-IgA (alpha)】

在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里,只需要檢測樣本里的IgG或者IgM,常規(guī)的Anti-IgG (H+L)由于與IgG的重鏈和輕鏈都有結(jié)合反應(yīng),而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域,因此不能特異性的檢測某種類型的IgG或者IgM。這時(shí)候就需要針對特殊類型Ig分子的二抗。按照標(biāo)記分,有HRP、AP、生物素等標(biāo)記二抗,F(xiàn)ITC、TRITC、Rhodamine、Cy3/5、Dylight等熒光二抗;按照檢測物種分,有抗人、大鼠、小鼠、豬、驢、綿羊、山羊、小雞、馬、兔、倉鼠、狗、牛,以及多種細(xì)菌類二抗;另外,還有IgG、IgA、IgM以及IgG(Fc)、IgG(ab’)2等不同類型抗體。

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